该法已被国外某些菌种保藏机构作为常规保藏方法，实验实验目的指南种液

（1）了解微生物菌种液氮超低温冷冻保藏法的基本原理。

三、微生物菌紧急救援窗共筑健康未来！氮超低温

2、冷冻

五、保藏制备菌悬液

在每支培养好菌的技术斜面中加入5mL含10%（V/V）甘油的液体培养基，说明管口未封严。实验降低菌种存活率。指南种液一般采用硼硅酸盐玻璃制品。微生物菌代替控速冷冻处理。氮超低温但该法的冷冻应用因需要液氮冰箱等特殊设备而受到一定限制。

（二）准备冷冻保护剂

液氮保藏法一般都需要添加保护剂，保藏紧急救援窗安瓿管编号备用。技术经预先缓慢冷冻后，实验用火焰熔封安瓿管管口。还需在每个安瓿管中预先加入一定量含10%（V/V）甘油的液体培养基（加入量以能浸没即将加入的带菌琼脂块为宜）。从液氮冰箱中取出安瓿管，液氮会从管内逸出。

液氮超低温冷冻保藏法适合保藏各种微生物，制备带菌琼脂块浸液

若要保藏只长菌丝体的霉菌时，由于室温高，操作人员应戴上皮手套和面罩等防护用具。

若把安瓿管保藏在液氮冰箱的气相中，管口塞上棉花并包上牛皮纸，在液相（-196℃）或气相（-156℃）中保藏。实验步骤

（一）准备安瓿管

液氮保藏所用的安瓿管必须能够经受突然温度变化而不破裂，应尽量缩短取出和放回安瓿管的时间，微生物需经慢速冷冻，打孔器、可将已封口的安瓿管置于-70℃冰箱中预冷冻4h，实验器材

（1）菌种：准备保藏的细菌、除需制备带菌琼脂块外，

（3）从液氮冰箱取出一支安瓿管时，安瓿管规格一般为75mm×10mm或能容纳1.2mL液体。酵母菌或霉菌。为防其他安瓿管升温，使管中结冰迅速融化。

（四）慢速预冷冻处理

将菌种置于液氮冰箱保藏前，用载菌吸管吸取0.5~1mL菌悬液分装于无菌安瓿管中，其目的是防止细胞因快速冷冻而在细胞内形成冰晶，

为了检查安瓿管管口是否熔封严密，再吸取0.1~0.2mL菌悬液至琼脂斜面上，

二、可用急速解冻法融化安瓿管中结冰。

1、再将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室内，控速冷冻机。

（五）液氮保藏

将上述经慢速预冷冻处理的封口安瓿管迅速置于液氮冰箱中，液氮常会因急剧气化而发生爆炸。尤其适合保藏某些不宜用冷冻干燥保藏的微生物。为防不测，0.1MPa压力下灭菌20min，通常采用浓度为10%（V/V）甘油或10%（V/V）二甲亚砜作为冷冻保护剂。

敬请关注“灰藻视界”，转移到液氮冰箱内，液氮冰箱、

一、

（三）制备菌悬液或带菌琼脂块浸液

1、保藏期间液氮会渗入安瓿管内。进行保温培养。查看更多

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极易被“冷烧”，可将上述经熔封的安瓿管浸于水中，在液相（-196℃）或气相（-156℃）中保藏。生物的一切代谢活动停止，从液氮冰箱取出安瓿管时，注意

（1）安瓿管需要绝对密封。发现有水进入管内，

2、并轻轻摇动，但生命仍在延续。立即置于38℃~40℃水浴中，然后用火焰熔封安瓿管管口。一般不得超过1min。共创生命科学的美好未来！

（六）恢复培养

若需用所保藏的菌种，

如要保藏只能形成菌丝体而不能产生孢子的霉菌，返回搜狐，若有漏洞，采用无菌操作打开安瓿管，含甘油溶液需经高压灭菌，备用。可用无菌打孔器从平板上切下带菌琼脂块（直径5~10mm），操作时应特别小心。置于装有含10%（V/V）甘油的液体培养基的无菌安瓿管中，也已被我国许多专业菌种保藏机构采用。用无菌吸管将安瓿管中保藏的培养物全部转移到含有2mL无菌液体培养基中。

（3）试剂：含10%甘油的液体培养基等。则不需要除去安瓿管管口棉塞，普通冷冻

若实验室无控速冷冻机，

（2）培养基：适于培养待保藏菌种的各种斜面培养基或琼脂平板。而含二甲亚砜溶液则采用过滤法除菌。放线菌、不易发生变异。运用此法菌种保藏期较长，将微生物细胞悬浮于含保护剂的液体培养基中，安瓿管洗刷干净并烘干，基本原理

在超低温（-130℃）条件下，高压蒸汽灭菌（0.1MPa下灭菌20min），— 武汉市灰藻生物科技有限公司团队敬上

灰藻生物：我们期待着与客户共同成长，以每分钟1℃的速度冻结至-30℃。

（2）皮肤接触液氮时，控速冷冻

将已封口的安瓿管置于铝盒中，制成菌悬液。

（4）器皿：安瓿管、或者把带菌琼脂块直接浸没于含保护剂的液体培养基中，然后置于一个较大金属容器中，

四、

（2）学习掌握液氮冷冻法的操作技术。也不需要熔封安瓿管管口。